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    法醫SNP分型與應用規范

    • admin
    • 2020-12-08 23:14:20
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    法醫SNP分型與應用規范-SF/Z JD0105003-2015(2015年11月20日發布實施)

    1 范圍
    本技術規范規定了法庭科學 DNA實驗室用微測序法進行法醫 SNP分型的要求及結果判斷標準(采用微測序法作為 SNP分型技術的說明見附錄 A)。
    本技術規范適用于法庭科學采用 SNP進行個體識別和親緣關系鑒定兩個領域。 

    2 規范性引用文件
    下列文件對于本技術規范的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本技術規范。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本技術規范。 
    GA/T 382-2014 法庭科學DNA實驗室建設規范 
    GA/T 383-2014 法庭科學DNA實驗室檢驗規范 
    GA/T 965-2011 法庭科學DNA親子鑒定規范 
    CNAS-CL08:2013 司法鑒定/法庭科學機構能力認可準則 
    CNAS-CL28:2014司法鑒定/法庭科學機構能力認可準則在法醫物證 DNA鑒定領域的應用說明 
    SF/Z JD0105001-2010 親權鑒定技術規范 

    3 術語和定義
    下列術語和定義適用于本技術規范。 
    3.1
    單核苷酸多態性 Single nucleotide polymorphisms(SNPs)
    指人群中正常個體基因組的單個堿基的變異,且最小等位基因頻率大于 1%。 
    3.2微測序法 minisequencing technique
    指基于引物延伸原理進行單個堿基序列分析的技術,也稱引物延伸法?;驹硎窃诰o鄰已知 SNP位點的上游設計引物,在僅有 ddNTP存在條件下進行測序反應時,延伸反應在延長一個堿基時終止,然后通過檢測 ddNTP標記物的特征確定延伸單個堿基的種類。 
    3.3 SNaPshot方法 SNaPshot assay
    是一種基于熒光標記 ddNTP單堿基延伸原理用于 SNP分型的微測序技術。同一反應體系中若含有針對不同 SNP的等位基因特異性引物,而它們 5’端長度不同,則可實現多個 SNP同步分析。 
    3.4 匹配概率 probability of matching(Pm)
    指一名與案件沒有關系的隨機個體純粹由于機會與檢材分型結果一致的概率。 
    3.5 似然率 likelihood(LR)
    是評估遺傳分析提供證據強度的指標。數值上似然率是兩個條件概率的比值。在個人識別時兩個條件概率的假設分別是,現場檢材是嫌疑人所留(原告假設)和現場檢材是一個與案件無關的隨機個體所留(被告假設)。似然率提供了基于術語“支持”的簡單約定,以便根據一定數據來支持一種假設,排斥另一種假設。 
     
    4 檢驗程序 
    4.1檢材的提取和保存按照 GA/T383-2014中的要求進行。 
    4.2 DNA提取與定量分析按照 GA/T 383-2014中的要求進行。 
    4.3 SNP分型 
    4.3.1 采用基于微測序的 SNaPshot方法進行 SNP分型。分型方法包括: PCR擴增、引物延伸反應和電泳分型。 
    4.3.2 PCR擴增 
    4.3.2.1  PCR擴增試劑、儀器、反應體系及循環參數:按照 GA/T383-2014中的要求進行。 
    4.3.2.2 在法醫學領域應用 SNP進行個人識別和親緣關系鑒定時,本規范建議可在以下 SNP中選擇:
    a)【常染色體 SNP】 
    1) 二等位 SNP: 
    rs740910、rs1490413、rs1335873、rs1979255、rs1493232、rs2040411、rs1528460、rs717302、 rs251934、rs8037429、rs891700、rs901398、rs873196、rs964681、rs737681、rs1463729、 rs1360288、rs1382387、rs1413212、rs2056277、rs2107612、rs1015250、rs1005533、rs729172、 rs10495407、rs1357617、rs719366、rs1031825、rs733164、rs938283、rs2111980、rs1886510、 rs914165、rs354439、rs763869、rs2076848、rs1024116、rs1355366、rs735155、rs1454361、 rs727811、rs917118、rs2831700、rs907100、rs1029047、rs2046361、rs722098、rs876724、 rs2016276、rs826472、rs2830795、rs1028528。 
    2) 三等位 SNP: 
    rs1630312、rs3091244、rs2069945、rs6001030、rs140676、rs356167、rs941454、rs10045、 rs3743842、 rs2298556、 rs3816662、 rs2307223、 rs10811897、 rs17287498、 rs385780、 
    rs11141033、rs4540055、rs3812847、rs2032582、rs2278786。
    b)【非常染色體 SNP】 
    1) Y染色體 SNP: 
    rs11096433、M145、rs9306845、rs9786479、rs17276358、rs2075640、M134、M88、M95、 rs16980426、rs17323322、M122、rs13447354、M89、rs9786707、M15、rs16980711、M9、 rs17316592、rs17276345。 
    2) X染色體:
    rs2056688、rs2128519、rs1534285、rs763056、rs1373592、rs993010、rs1557054、rs1243792、 rs925178、rs1207480、rs1936313、rs1977719、rs1372687、rs1857602、rs985425、rs933315、 rs2190288、rs1991961、rs1931662、rs149910、rs1573704、rs1340718、rs1930674、rs1339597、 rs1981452。 
    3) 線粒體 SNP: 
    709、1719、1736、3010、3394、3970、4216、4883、5147、5417、5460、6392、6455、 8584、8701、9090、10397、10398、11914、12705、13708、13928、14318、14783、15487、 16519。
    注:在上述 SNP基礎上可增加文獻報道且經驗證的其它 SNP,以提高檢測的系統效能。 
    4.3.3引物延伸反應擴增產物使用核酸外切酶(Exo)和蝦堿性磷酸酶 (SAP)進行純化。在 Exo和 SAP酶處理后的PCR產物中加入SNP的單堿基延伸引物、 SNaPshot mix進行單堿基引物延伸反應,反應完成后,通過向產物中加入 SAP來消化未結合的熒光素標記的 ddNTP。 
    4.3.4電泳分型使用遺傳分析儀,對 PCR產物進行毛細管電泳分析,數據分析可使用為觀測峰的顏色和片段長度范圍涉及的 Genotyper或 GeneMapper ID等軟件進行 
    SNP分型。具體步驟按照儀器或軟件操作手冊進行。 

    5 SNP分型結果分析 
    5.1分型結果的說明 
    5.1.1 峰的位置與 SNP遺傳標記 5’端加尾的長度有關,表示相互區別的不同位點。純合子以單峰形式出現,雜合子通常以不同顏色峰顯示。 
    5.1.2 峰的顏色表示所選擇的SNP的核苷酸信息,四種脫氧核糖核苷酸標記不同顏色的染料: A(綠色), G(藍色), C(黃色,為了達到更好的視覺效果,通常顯示為黑色), T(紅色)。因此,在電泳圖譜中出現一個綠色峰,表明一個 A(ddATP)通過聚合酶結合在 SNP上。 
    5.2分型結果的基本要求 
    5.2.1確認內標峰高閾值大于 100相對熒光單位,且每一內標峰標定正確。 
    5.2.2確認已知陽性參照物的分型結果正確,陰性參照物無等位基因峰。 
    5.2.3樣本分型圖譜清晰,且峰高大于 100相對熒光單位。 
    5.3拔起峰的分析 
    5.3.1拔起峰(pull up峰)指含有熒光染料的單堿基延伸反應產物從一個光譜通道擴散到另一個通道的結果在電泳圖譜中的呈現。 
    5.3.2每一種熒光染料都有不同波長的最大發射光譜,而當某一熒光染料過多造成 matrix去顏色疊加不能正常工作,會出現拔起峰的現象 
    5.3.3當一個樣本的 SNP分型圖譜中,與主峰處于同一縱軸線的其他所有顏色上均有相應的吸收峰時,判斷為拔起峰,通常由于超高峰所致。 
    5.3.4拔起峰可通過減少擴增時的樣本 DNA量、減少擴增循環數、減少單堿基延伸反應產物、重建光譜校正等來消除。
    5.4等位基因丟失的分析 
    5.4.1當 PCR擴增或單堿基延伸反應的模板在引物結合區發生突變,阻礙引物結合,會導致擴增失敗或引物延伸失敗,無法檢測到模板 DNA中本身存在的一個等位基因。 
    5.4.3考慮有等位基因丟失可能時,需更換 DNA序列不同的引物進行重新檢測。 
    5.5非特異峰的分析 
    5.5.1 PCR引物去除不全:表現為在電泳圖譜上出現的片段長度為比 PCR引物長度多 1個堿基的產物,為 Exo酶對 PCR引物消化不全,可加大 Exo酶量消化后去除。 
    5.5.2 ddNTP去除不全:未經消化的 ddNTP常出現在大于70bp的位置,超量的ddNTP也會出現在較短片段位置,為SAP對未結合的熒光素標記的 ddNTP消化不完全所致,可通過加大 SAP量消化后去除,由于 ddNTP是熒光素標記的,該原因導致的額外峰也稱為染料峰。 
    5.5.3熒光污染:由于抗菌素、維生素、多環芳香族化合物、熒光助色物質、各種紡織染料等有熒光,導致出現非特異峰也稱熒光污染峰,通常比較寬,擁有較寬的熒光光譜范圍,可通過有機提取法去除。 
    5.5.4其它:還有由氣泡、尿素結晶或電壓波動引起的非特異峰稱為偽峰,通常尖聳且出現在四種顏色的相同位置,沒有重復性。 

    6 SNP分型結果表示
    分型結果的描述: SNP檢驗結果以表格的形式列出,標明檢材或樣本的編號、 SNP名稱及等位基因分型。等位基因以 A、C、G、T表示,等位基因間以“/”分隔;純合子只標出 
    1個;未得到分型或無法明確判定分型的標為“-”。 
     
    7 SNP分型結果應用 
    7.1補充個人識別鑒定 STR基因座被廣泛應用于 DNA數據庫建立和實際案件鑒定的個體識別。當犯罪現場提取的物證為降解檢材時, SNP分型結果可作為補充鑒定應用于個體識別,即通過比較案發現場收集到的法醫物證檢材與嫌疑人的 SNP遺傳標記,判斷前后兩次或多次出現的個體是否為同一個體。若兩份檢材的 SNP分型不同,可判斷兩份檢材不是來自同一個體;若 SNP分型相同,則稱為兩份檢材的 SNP分型匹配,即不能排除兩份檢材來自同一個體。 
    7.2 輔助親緣關系鑒定當 STR系統的分型結果不足以確定某些復雜親緣關系時, SNP可以作為補充鑒定的遺傳標記。常染色體 SNP符合孟德爾遺傳規律,即子代的等位基因一個來自于父親,一個來自于母親。在有爭議的父母和孩子三份樣本所檢測的多個 SNP分型結果中,孩子的一對等位基因分別在有爭議父母的基因型中找到來源時,不排除該有爭議父母為孩子的生物學父母。 Y染色體、X染色體和線粒體SNP可在某些特殊的親緣關系鑒定中作為補充鑒定的遺傳標記使用。 
     
    8 SNP分型結果評估 
    8.1個人識別
    8.1.1 匹配。兩份檢材所檢測的多個 SNP均相同時判斷為匹配。兩份檢材遺傳標記分型匹配有兩種可能的原因:①兩份檢材來自同一個體;②兩份檢材不是來自同一個體,理論上可能來自群體中的一名隨機個體,僅僅因其遺傳標記碰巧相同而出現了匹配。此時可以通過計算匹配概率來估計一個理論上的隨機個體碰巧匹配的可能性有多大。匹配概率按附錄 B計算,似然率按附錄 C計算。 
    8.1.2 不匹配。在排除拔起峰、等位基因丟失、非特異峰等前提下,兩份檢材在所檢測的 SNP中有兩個及以上不同時判斷為不匹配。 
    8.1.3 兩份檢材在所檢測的 SNP中只有一個不同時,不能排除兩份檢材來自同一個體,需增加檢測更多 SNP。增加檢測更多 SNP后,兩份檢材在所檢測的 SNP中有兩個及以上不同時判斷為不匹配。 
    8.2 親子鑒定 
    SNP作為親子鑒定的補充遺傳標記。累積非父排除概率和累積父權指數按 GA/T 965-2011或 SF/Z JD0105001-2010中的要求計算。對于不符合遺傳規律的 SNP,PI取值可為 0.00001. 
    8.3 SNP與 STR的同時使用
    當 SNP與 STR同時使用時,或多個 SNP同時使用時,需有證據表明 SNP與 STR是相互獨立的,或 SNP之間是相互獨立的。不能證明相互獨立時按單倍型計算。

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