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    親權鑒定技術規范(2010版)

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    • 2020-12-08 23:08:28
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    親權鑒定技術規范-SF/Z JD0105001-2010-(2010年4月7日發布實施)
    1 范圍
        本標準規定了我國法醫DNA實驗室進行親權鑒定所必須遵循的技術要求。
        本標準適用于從事親權鑒定的DNA實驗室,不適用于大通量數據庫的比對。
    2 規范性引用文件
        下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本部分的條款。凡是注明日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準,然而,鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可適用這些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件,其最新版本適用于本部分。
        CNAS-CL01:2006 檢測和校準實驗室認可準則
        GA/T382-2002 法庭科學DNA實驗室規范
        GA/T383-2002 法庭科學DNA實驗室檢驗規范
    3 術語和定義
        下列術語和定義適用于本標準。
    3.1  親權鑒定 Parentage Testing
    親權鑒定是通過對人類遺傳標記的檢測,根據遺傳規律分析,對個體之間血緣關系的鑒定。
    3.2  三聯體親子鑒定 Parentage Testing of Trios
        被檢測男子、孩子生母與孩子的親子鑒定
    3.3  二聯體親子鑒定 Parentage Testing of Duos
        被檢測男子與孩子的親子關系鑒定。
        注:被檢測女子與孩子的親子關系鑒定也屬于二聯體親子鑒定,但本標準界定的是被檢測男子與孩子的親子關系鑒定。
    3.4  祖孫親緣關系鑒定 Kinship Analysis of Grandparents and Grandchildren
        祖孫親緣關系鑒定是通過對人類遺傳標記的檢測,根據遺傳規律分析,對有爭議的祖父母與孫子女血緣關系的鑒定。
    3.5  遺傳標記 Genetic Marker
    具有多態性的基因座。用于親子鑒定的遺傳分析系統由一定數量的遺傳標記組成,常用的有常染色體短串聯重復序列(STR)、Y染色體短串聯重復序列(Y-STR)、X染色體短串聯重復序列(X-STR)。
    3.6  排除概率 Power of Exclusion, PE
        對于不是孩子生父的隨機男子,遺傳分析系統具有的排除能力。它是遺傳分析系統效能的評估指標。
    3.7  親權指數 Paternity Index, PI
        親權指數是親權關系鑒定中判斷遺傳證據強度的指標。它是兩個條件概率的似然比率:
        PI =  概率(檢測到當事人的遺傳表型假設被檢測男子是孩子的生物學父親)÷
    概率(檢測到當事人的遺傳表型假設一個隨機男子是孩子的生物學父親)

    4   檢驗程序
    4.1 采樣要求
        對于三聯體,采集被檢測男子、孩子生母與孩子的樣本用于檢驗;對于二聯體,采集被檢測男子與孩子的樣本用于檢驗;對于祖父母與孫的鑒定案例,則采集被檢測祖父、祖母、孩子生母與孩子的樣本用于檢驗。樣本一般是血液(斑)或口腔拭子(唾液斑),其它人體生物學材料如帶毛囊毛發、羊水、組織塊、精液(斑)等亦可作為親權鑒定的樣本。樣本必須分別包裝,注明被采樣人姓名、編號、采樣人、采樣日期等,置于冰箱冷藏或凍存。
        采樣時,需要填寫采樣單,寫明委托方名稱、采樣日期、采樣類型、被采樣人姓名、性別、稱謂、出生日期、證件號碼等,并拍攝被采樣人照片,由被采樣人在采樣單上留下右手拇指或食指指紋(嬰兒可留右腳拇趾?。?,并簽名確認(嬰幼兒的姓名由其監護人代簽)。
        對于接受了外周血干細胞移植的當事人,應避免采集其血樣作為檢驗材料,宜取其口腔拭子(唾液斑)或毛發進行檢驗。
    4.2 DNA提取
        采用Chelex-100法(見如下步驟)或其它經過了驗證的方法抽提DNA。若不經過DNA抽提而直接將檢材用于PCR,方法必須經過驗證。
    4.2.1  從血樣中提取DNA:
        a)   在1.5 mL離心管中加1 mL 純水,然后加入血樣(不少于3 µL血液或9 mm血斑),小心混勻;放置30 min,間歇振蕩;
        b)   10,000-15,000 r/min離心2-3 min;小心移去上清液。若樣品為血斑,則保留載體;
        c)   沉淀中加入5% Chelex 100(100-200目)200 µL,56℃保溫30 min;
        d)   高速振蕩5-10 s;沸水浴8 min;
        e)   高速振蕩5-10 s;10,000-15,000 r/min離心2-3 min,取上清液用于擴增反應;2-8℃保存或凍存剩余DNA。
    4.2.2  從口腔刮拭物樣本中提取DNA:
        a)   用牙簽刮拭口腔粘膜,將其放入1.5 mL離心管內,加入200 µL 5% Chelex(100-200目);攪動,使細胞脫落;
    b)   56℃保溫15-30 min;
        c)   高速振蕩5-10 s,沸水煮8 min;
        d)   高速振蕩5-10 s,10,000-15,000 r/min離心2-3 min;
    e)   取上清液用于擴增反應;2-8℃保存或凍存剩余DNA。
    (STR分型檢測一般實驗對樣本的要求10萬個細胞以上即可,盡管對于口腔拭子樣本一根棉簽上就可以附著10萬個口腔黏膜細胞,但作為DNA親子鑒定樣本, 在方便采集的情況下,盡可能采集5-6根棉簽。根據我國2010年4月10日國家發布的親權鑒定技術規范SF/Z JD0105001-2010中的規定口腔拭子提取DNA……
    STR分型檢測一般實驗對樣本的要求:細胞數量≥106個,DNA含量>20ng/µl,體積大于20µl。對于毛發樣本一般提供最少5根帶毛囊的毛發(同時要求5歲以上的,因為5歲以下的毛囊長得不是很完全)。根據我國2010年4月10日國家發布的親權鑒定技術規范SF/Z JD0105001-2010中的規定毛發拭子提取DNA……
    4.2.3  從毛發中提取DNA:
        a)   用純水清洗毛發;剪取毛根部分,放入1.5 mL Eppendorf管中;
        b)   加入200 µL 5% Chelex 100(100-200目)及2 µL 10 mg/mL PK(蛋白酶K),56℃保溫6-8 hr或過夜;
        c)   高速振蕩5-10 s;沸水煮8 min(注意毛發應浸沒于Chelex液中);
        d)   高速振蕩5-10 s;10,000-15,000 r/min離心2-3 min;取上清液用于擴增反應,2-8℃保存或凍存剩余DNA。
    4.2.4  從精液中提取DNA:
        a)   取精液(不少于3 µL)放入1.5 mL離心管內,加入200 µL 5% Chelex 100(100-200目);
        b)   加入2 µL 10 mg/mL蛋白酶K和7 µL 1 mol/L DTT,輕輕混勻;
        c)   56℃保溫30-60 min,高速振蕩5-10 s;
        d)   10,000-15,000 r/min離心10-20 s;
        e)   沸水煮8 min;
        f)   高速振蕩5-10 s;
        g)   10,000-15,000 r/min離心3 min;
        h)   取上清液用于擴增反應;
        i)   2-8℃保存或凍存剩余DNA, 再次使用時重復步驟f)-h)。
    4.2.5  從精斑樣品中提取DNA:
        a)   適量精斑檢材,剪碎后放到1.5 mL離心管中;
        b)   加入1 mL純水,室溫保溫30 min;
        c)   高速振蕩1 min,用牙簽去除載體;
        d)   10,000-15,000 r/min離心2 min;
        e)   去上清僅留50 µL,用無菌吸頭吹打沉淀;
        f)   加入5% Chelex 100 100-200目)至200 µL,加入2 µL 10mg/mL蛋白酶K和7 µL 1 mol/L DTT,輕輕混勻;
        g)   56℃保溫60 min;
        h)   高速振蕩5-10 s,10,000-15,000 r/min離心10-20 s;
        i)   沸水煮8 min;
        j)   高速振蕩5-10 s,10,000-15,000 r/min離心3 min;
        k)   取上清液用于擴增反應;
        l)   2-8℃保存或凍存剩余DNA,再次使用時重復步驟i)-k)。
    從人體組織塊中提取DNA:
        a)   取適量組織塊,用純水沖洗;
        b)   剪碎(或研磨成碎塊),加入1 mL STE提取液(100 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-HCI,1 mmol/LEDTA,pH8.0),混勻后加入20% SDS 75 µL,10 mg/mL 蛋白酶K 40 µL,于56℃酶解至清;
        c)   于1.5 mL離心管中加入200 µL 10% Chelex 100(100-200目),加入上述酶解后溶液20 µL,混勻;
        d)   56℃保溫30 min;
        e)   劇烈振蕩5-10 s;
        f)   沸水煮8 min;
        g)   劇烈振蕩5-10 s;10,000-15,000 r/min離心3 min;取上清液用于擴增反應;
        h)   2-8℃保存或凍存剩余DNA,再次使用時重復步驟g)。
    4.2.7  從羊水中提取DNA:
        a)   取羊水約1.5 mL,10,000~15,000 r/min離心5 min,棄上清;
        b)   在沉淀中加入200 µL 5% Chelex(100-200目)溶液和20 µL 10 mg/mL PK,56℃保溫3 hr;
        c)   高速振蕩5-10 s,沸水浴8 min;
        d)   高速振蕩5-10 s,10,000~15,000 r/min離心5 min,取上清液用于擴增反應;
        e)   2-8℃保存剩余DNA,再次使用時重復步驟d)。
    4.3 DNA定量分析
        按照中華人民共和國公共安全行業標準GA/T382-2002和GA/T383-2002的要求進行。
    4.4 PCR擴增與分型
    4.4.1 基因座
        選用多態性基因座(如STR、SNP等類型)進行PCR擴增,其中,常染色體STR基因座宜符合如下要求:(1)經過群體遺傳學調查,多態性高,非父排除率在0.7以上。(2)經過500次以上減數分裂的家系調查,基因座的突變率在0.002以下。目前,建議采用商品化試劑盒進行檢驗,檢測系統的累計非父排除率應達到99.99%以上。除常染色體基因座外,建議在需要時增加Y-STR、X-STR的檢驗。其中,Y-STR系統可選擇DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS458、DYS19、DYS385 a/b、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、Y GATA H4、DYS437、DYS438、DYS448等基因座進行單倍型檢驗;X-STR系統可選用GATA172D05、HPRTB、DXS6789、DXS6795、DXS6803、DXS6809、DXS7132、DXS7133、DXS7423、DXS8377、DXS8378、DXS9895、DXS9898、DXS10101、DXS10134、DXS10135、DXS10074等。
    4.4.2 擴增試劑
        建議選用商品化試劑盒(帶熒光標記的PCR體系)。若選用其它來源的擴增體系,須經驗證、認可后方可用于日常檢案。每批檢驗均應用標準樣品(已知濃度和基因型的Control DNA)和(或)以前檢驗過的、已知基因型的樣本作為陽性對照,以不含DNA的樣本作為陰性對照。
    4.3 PCR體系與溫度循環參數
        按試劑盒的操作說明書進行。
    4.4.4 擴增產物的檢測與結果的判讀
        使用熒光分析儀,對PCR產物進行毛細管電泳分析,使用等位基因階梯(Ladder)作為參照品來判別樣本的基因型,步驟方法按照儀器操作手冊。
    4.5 鑒定意見
        鑒定意見是依據DNA分型結果對是否存在親權關系作出的判斷。鑒定意見一般分“排除存在親權關系”和“支持存在親權關系”兩種情形。
    4.5.1 排除存在親權關系
        經過累計非父排除率大于99.99%的多個基因座的檢測,發現有3個以上的基因座不符合遺傳規律,可以排除親權關系的存在。
    4.5.2 支持存在親權關系
        經過累計非父排除率大于 99.99%的多個基因座的檢測,發現基因座均符合遺傳規律,此時必須計算親權指數PI(即似然率LR),若CPI≥10000,則支持親權關系的存在。
    4.5.2.1  累積親權指數計算:
        CPI=PI1×PI2×PI3×…×PIn (1、2、3、n代表第1、2、3、n個基因座的PI值)
    4.5.2.2 常染色體STR體系各種遺傳組合PI值計算方法:
        見表1~3,表中p、q、r分別表示等位基因P、Q、R的分布頻率。
    表1 三聯體常染色體STR基因座親權指數計算公式
    生母基因型 孩子基因型 生父基因(推斷) 被檢父基因型 PI值計算公式
    PP PP P PP 1/p
    PP PQ Q QQ 1/q
    PP PP P PQ 1/(2p)
    PP PQ Q QR 1/(2q)
    PP PQ Q PQ 1/(2q)
    PQ QQ Q QQ 1/q
    PQ QR R RR 1/r
    PQ QR R RS 1/(2r)
    PQ PR R PR 1/(2r)
    PQ QQ Q QR 1/(2q)
    PQ PQ P或Q PP 1/(p+q)
    PQ PQ P或Q QQ 1/(p+q)
    PQ PQ P或Q PQ 1/(p+q)
    PQ PQ P或Q PR 1/[2(p+q)]
        表2 二聯體常染色體STR基因座親權指數計算公式
    孩子基因型 被檢父基因型 PI值計算公式
    PP PP 1/p
    PP PQ 1/(2p)
    PQ PP 1/(2p)
    PQ PQ (p+q)/(4pq)
    PQ PR 1/(4p)
        表3 祖孫常染色體STR基因座親權指數計算公式
    祖父母 孩子 孩子生母 孩子生父基因 親權指數計算公式
    PR × QS           PQ PQ P或Q 1/[2(p+q)]
      PQ × PR PQ PQ P或Q 3/[4(p+q)]
    PQ × PQ PQ PQ P或Q 1/(p+q)
    PP × PQ PQ PQ P或Q 1/(p+q)
    PP × PQ PQ QS P 3/(4p)
    PR × RS PP PQ P 1/(4p)
    PR × QS PP PQ P 1/(4p)
    PQ × PR PP PQ P 1/(2p)
    PQ × PQ PP PQ P 1/(2p)
    PR × RS PP PP P 1/(4p)
    PR × QS PP PP P 1/(4p)
    PQ × PR PP PP P 1/(2p)
    PQ × PQ PP PP P 1/(2p)
    4.5.2.3  Y-STR檢測系統的PI值計算
        PI=1/f (f指單倍型在群體中的頻率)
    4.5.2.4   X-STR檢測系統的PI值計算(見表4、表5)
        表4 三聯體X染色體STR基因座親權指數計算公式
    孩子生母基因分型結果 女孩基因分型結果 被檢父基因分型結果 PI值計算公式
    PP PP P 1/p
    PQ PP P 1/p
    PP PQ Q 1/q
    PQ PQ P 1/(p+q)
    PQ PR R 1/r
        表5 二聯體X染色體STR基因座親權指數計算公式
    女孩樣本分型結果 被檢父樣本分型結果 PI值計算公式
    PP P 1/p
    PQ P 1/(2p)
    4.6 檢驗過程中特殊情況的處理
        a)經DNA檢測(系統的累計非父排除率在99.99%以上),發現各基因座符合相應的遺傳定律,2000<CPI<10000,增加檢測其它的具有高度多態性且遺傳穩定的DNA遺傳標記亦未發現不符合遺傳規律的基因座,可據此支持親權關系的存在。
        b)經常染色體DNA檢測(系統的累計非父排除率在99.99%以上),發現1~2個基因座不符合相應的遺傳定律(考慮存在突變),這種情形下,應增加檢測其它的高度多態性且遺傳穩定的STR基因座;若被檢驗的孩子為女孩,應盡可能對被檢父母與女孩增加檢測 X-STR;若被檢驗的孩子為男孩,且被檢父與孩子可能的生父不屬同一父系,應盡可能對被檢父與男孩增加Y-STR的檢驗。將突變基因座寫入報告書中,并按突變基因座PI值的計算方法(見備注)計算PI和CPI值。計算后若發現CPI≤0.0001,則據此排除親權關系;若0.0001<CPI<10000,則不排除親權關系。
        備注1:若三聯體中存在不符合遺傳規律的常染色體遺傳標記,如孩子的表型為PQ,被檢測男子表型為P'R,其中P'比P 小或大1個或2個重復單位(s=1或2),µ為該基因座平均突變率,p為等位基因P的頻率,親權指數計算方法為:
        突變為1步(s=1), 則: PI =X/Y = µ/(4p)
        突變為2步(s=2), 則: PI =X/Y = µ/(40p)
        突變為3步(s=3), 則: PI =X/Y = µ/(400p)
        余此類推(見表6)
        表6 三聯體中存在不符合遺傳規律的遺傳標記時親權指數計算實例
        (以D7S820為例,平均突變率µ為0.002 )
    基因座 孩子生母 孩子 被檢測父親 親權指數
    D7S820 7 7-8 9-11 µ/(4P8)
    D7S820 7 7-8 10-11 µ/(40P8)
    D7S820 7 7-8 11-12 µ/(400P8)
    D7S820 7 7-8 9 µ/(2P8)
    D7S820 7-8 8 9 µ/(2P8)
    D7S820 7-8 8 7-9 2µ/(4P8)
    D7S820 7-8 8 9-11 µ/(4P8)
    D7S820 7-9 7-9 10-11 µ/[4(P7 + P9)]
    D7S820 7-9 7-9 10 µ/[2(P7 + P9)]
    D7S820 7-9 7-9 8-10 3µ/[4(P7 + P9)]
    D7S820 7-8 7-9 7-8 µ(1+1/3.5)/(4P9)
    D7S820 9 7-8 7 µ /(2×3.5×P8)
        注:表中P7、P8、P9為相應等位基因7、8、9的頻率
        備注2:若二聯體中存在不符合遺傳規律的常染色體遺傳標記,如孩子的表型為PQ,被檢測男子表型為P'R,其中P'比P 小或大1個或2個重復單位(s=1或2),µ為該基因座平均突變率,p為等位基因P的頻率,則親權指數計算方法為:
        突變為1步(s=1),則: PI =X/Y = µ/(8p)
        突變為2步(s=2),則: PI =X/Y = µ/(80p)
        突變為3步(s=3),則: PI =X/Y = µ/(800p)
        余此類推(見表7)
        表7 二聯體中存在不符合遺傳規律的遺傳標記時親權指數計算實例
        (以D7S820為例,平均突變率µ為0.002 )
    基因座 孩子 被檢測男子 親權指數
    D7S820 7-8 9-11 µ/(8P8)
    D7S820 7-8 10-11 µ/(80P8)
    D7S820 7-8 11-12 µ/(800P8)
    D7S820 7-8 9 µ/(4P8)
    D7S820 8 9 µ/(2P8)
    D7S820 8 7-9 2µ/(4P8)
    D7S820 8 9-11 µ/(4P8)
    D7S820 7-9 8-10 µ(2P7+P9)/(8P7P9)
    D7S820 7-9 8 µ(P7+P9)/(4P7P9)
        注:表中P7、P8、P9為相應等位基因7、8、9的頻率
    c)   若被檢父與可能的生父存在特殊的血緣關系(如父子關系、叔侄關系、同胞兄弟關系等),在可能的情況下,應同時提取孩子生母和其他的可疑父親的樣本進行檢驗。
    d)   在祖孫關系鑒定中,經常染色體DNA檢測(系統的累計非父排除率在99.99%以上),若發現1~2個基因座不符合相應的遺傳定律(考慮存在突變),應增加檢測其它的高度多態性且遺傳穩定的STR基因座;若被檢驗的孩子為女孩,應盡可能對被檢祖母與孫女增加X-STR的檢驗;若被檢驗的孩子為男孩,應盡可能對被檢祖父與孫子增加Y-STR的檢驗。若仍然只有原來的基因座不符合遺傳規律,則將這些基因座當作突變基因座處理,寫入報告書中,出具“不排除存在生物學祖孫關系”的鑒定意見。

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